人胎盘微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.011

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (11): 1706-1711.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.011

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人胎盘微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

张慧丽^1，2，杜培丽¹，方元龙²，张镜²，何玉甜¹，孙斌¹，肖雪¹，孙雯¹，周燕媚¹，陈敦金¹

¹广州医科大学附属第三医院妇产科，广州市重症孕产妇救治中心，广州市妇产科研究所，广东省广州市 510150；²广州医科大学，广东省广州市 510000

修回日期:2014-02-17 出版日期:2014-03-12 发布日期:2014-03-12
通讯作者: 陈敦金，主任医师。广州医科大学附属第三医院妇产科，广州市重症孕产妇救治中心，广州市妇产科研究所，广东省广州市 510000
作者简介:张慧丽，女，1987年生，山东省烟台市人，汉族，广州医科大学在读硕士。
基金资助:
广东省自然科学基金(S2012010008932)；国家自然科学基金(81370775，81302399)；教育部项目基金(20114423110004)

Primary cultivation and identification of human placental microvascular endothelial cells

Zhang Hui-li^{1, 2}, Du Pei-li¹, Fang Yuan-long², Zhang Jing², He Yu-tian¹, Sun Bin¹, Xiao Xue¹, Sun Wen¹, Zhou Yan-mei¹, Chen Dun-jin¹

¹Department of Gynecology and Obstetrics, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Obstetric Critical Care Center of Guangzhou, Guangzhou Institute of Gynecology and Obstetrics, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China; ²Guangzhou Medical University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China

Revised:2014-02-17 Online:2014-03-12 Published:2014-03-12
Contact: Chen Dun-jin, Chief physician, Department of Gynecology and Obstetrics, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Obstetric Critical Care Center of Guangzhou, Guangzhou Institute of Gynecology and Obstetrics, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China
About author:Zhang Hui-li, Studying for master’s degree, Department of Gynecology and Obstetrics, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Obstetric Critical Care Center of Guangzhou, Guangzhou Institute of Gynecology and Obstetrics, Guangzhou 510100, Guangdong Province, China; Guangzhou Medical University, Guangzhou 510100, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2012010008932; the National Natural Science Foundation of China, No. 81370775, 81302399; Project Funds by the Education Ministry, No. 20114423110004

摘要/Abstract

摘要：

背景：建立高纯度的人胎盘微血管内皮细胞体外培养体系对研究胎盘功能是十分必要的。目前，国内外研究多采用三步酶消化法结合免疫磁珠法分离胎盘微血管内皮细胞，然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而，如何简化人胎盘微血管内皮细胞分离步骤，同时又能提高目标细胞纯度的体外培养方法成为研究热点。

目的：探索一种简便高效的从早期绒毛组织中分离人胎盘微血管内皮细胞的体外培养方法，观察细胞生长状态并进行鉴定。

方法：利用健康孕6-8周孕妇行人工流产后的绒毛组织，经两步酶消化法和非连续 Percoll密度梯度离心得到人胎盘微血管内皮细胞，传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。

结果与结论：实验成功获取人胎盘微血管内皮细胞，原代培养的人胎盘微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁，第10天进入对数生长期，第12至13天细胞浓度达80%，传代细胞较原代细胞生长活跃，培养5-7 d可长满培养瓶底，呈“铺路石样”排布。免疫荧光化学结果显示，培养的细胞中FⅧ因子与CD31相关抗原双荧光染色呈阳性，细胞阳性率达100%。MTT法测得培养第5代人胎盘微血管内皮细胞的生长曲线呈倒“S”形。结果证实，应用两步酶消化法、非连续 Percoll密度梯度离心法分离细胞，并利用胰酶消化法和反复贴壁法纯化细胞，可获得大量高纯度的人胎盘微血管内皮细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织工程, 血管内皮细胞, 人胎盘微血管内皮细胞, 早期绒毛组织, 原代培养, 免疫细胞荧光化学, 细胞鉴定, 胰酶消化, 纯化, FⅧ因子相关抗原, CD31, MTT法, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Establishment of in vitro culture system of human placental microvascular endothelial cells with high purity is very important. In recent studies, some scholars have successfully obtained a large number of placental microvascular endothelial cells by three-stepenzyme digestion and magnetic separation method, but the procedures were extremely complex and it had great damage to the cells. Therefore, how to separate human placental microvascular endothelial cells easily and obtain high-purified cells has become a research hotspot.

OBJECTIVE: To investigate an efficient method to isolate and purify human placental microvascular endothelial cells from early villus microvessels, observe the cell growth and identify the cells.

METHODS: The villi from normal early pregnancies (6-8 weeks) after artificial abortion were collected aseptically. Using two-step digestion procedure and discontinuous Percoll density gradient centrifugation method, human placental microvascular endothelial cells were obtained. Then the cells were identified by trypsin digestion method and repeated adherence method.

RESULTS AND CONCLUSION: Human placental microvascular endothelial cells were isolated successfully from early villi. The primary cells adhered to the walls after inoculated for 24 hours and entered logarithmic phase at 10 days. 80% of the cells achieved a confluence at 12-13 days after inoculating. The subculture cells grew swiftly with the typical cobblestone appearance. Immunofluorescence staining showed that, cultured human placental microvascular endothelial cells demonstrated a strong positive reaction to von Willebrand factor antigen and CD31, accounting for 100%. MTT assay results showed that, human placental microvascular endothelial cells at passage 5 exhibited an S-shaped growth curve. High-purity human placental microvascular endothelial cells can be obtained by proteolytic enzymes digestion and discontinuous Percoll density gradient centrifugation method, and the purity is detected by trypsin digestion method and repeated adherence method.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: placenta, endothelial cells, blood vessels, cells, fluorescent antibody technique

中图分类号:

R394.2

张慧丽，杜培丽，方元龙，张镜，何玉甜，孙斌，肖雪，孙雯，周燕媚，陈敦金. 人胎盘微血管内皮细胞的分离培养及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(11): 1706-1711.

Zhang Hui-li, Du Pei-li, Fang Yuan-long, Zhang Jing, He Yu-tian, Sun Bin, Xiao Xue, Sun Wen, Zhou Yan-mei, Chen Dun-jin. Primary cultivation and identification of human placental microvascular endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(11): 1706-1711.

图/表（结果） 2

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引言

胎盘对胎儿的正常发育起着至关重要的作用，而良好的胎盘血管网络的形成，是维持正常妊娠的前提。研究显示，胎盘功能障碍与不良妊娠结局密切相关，如胎儿生长受限、胎儿宫内窘迫及早产等^[1-3]。有鉴于此，通过建立体外胎盘模型来研究胎盘功能势在必行。作为胎盘血管床的主要构成部分之一，胎盘微血管内皮细胞(human placenta microvascular endothelial cells，HPMVECs)参与胎盘血管形成与重塑、调节血管舒缩，在维持胎盘血管床的血流稳态中发挥着重要作用^[1]。目前有关内皮细胞(endothelial cells，ECs)体外研究大多是从脐静脉或主动脉等其他血管上分离获得的^[4-6]，然而，内皮细胞是一种高度异质性的的组织，与其分布的部位密切相关，不同组织、器官，甚至同一血管不同节段的内皮细胞形态结构、表型及生理功能都表现出明显的差异^[7-11]。有研究还发现，脐静脉血管内皮细胞和胎盘微血管内皮细胞在形态结构、生长情况及分泌功能等方面均有一定差异^[12]。因此，建立胎盘微血管内皮细胞体外培养体系对研究胎盘功能是十分必要的。有研究成功从足月胎盘微血管中分离出内皮细胞^[13]，而后不断有学者对胎盘微血管内皮细胞的分离方法进行改进^[14-16]，但所能获得的内皮细胞数量仍然较少。还有研究通过三步酶消化法成功获得了大量的胎盘微血管内皮细胞，然而每经一步酶消化，都需将不同浓度、不同种类的酶进行组合，然后依次消化，步骤极度繁琐。还有学者在以往研究建立的14个非连续Perco Ⅱ密度梯度分选方法的基础上进行改进，将其简化为3个非连续Perco Ⅱ密度梯度，但所收获的内皮细胞最高纯度只有80%-85%^[17-18]。近年来，有研究采用免疫磁珠分选胎盘微血管内皮细胞，虽能获得较纯净的内皮细胞，然而磁珠分选法对细胞的损伤较大^[1]。因此，实验拟建立一种改良的胎盘微血管内皮细胞体外培养方案，通过酶消化法、非连续PercoⅡ密度梯度法及反复贴壁法，尽可能减少细胞损伤的同时能够在短时间内得到大量高纯度的胎盘微血管内皮细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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材料方法

设计：细胞学体外实验。

时间及地点：于2012年9至11月在广州医科大学附属第三医院妇科门诊完成。

材料：实验标本均来自广州医科大学附属第三医院妇科门诊2012年9至11月健康孕妇孕6-8周行人工流产术后的绒毛组织(50-70 g)。根据中华人民共和国国务院颁发的《医疗机构管理条例》^[19]，在实验前将实验方案告知对方，并签署知情同意书。

主要试剂配制：体积分数0.1%Ⅰ型胶原酶：0.05 gⅠ型胶原酶溶于DMEM 50 mL中。体积分数0.2%Ⅱ型Dispase酶：0.1 g Ⅱ型Dispase酶溶于50 mL PBS中。体积分数0.02%Ⅰ型DNA酶：0.01 gⅠ型DNA酶溶于50 mL PBS中。体积分数0.25%胰酶：0.25 g胰酶溶于50 mL PBS中。

完全培养液：加入终浓度为10×10⁴ U/L青霉素/链霉素溶液及终浓度为25 mg/L两性霉素B溶于高DMEM培养液 80 mL及20 mL优质胎牛血清中，制成100 mL完全培养液。

方法：

人胎盘微血管内皮细胞原代培养：消化：将绒毛本组织置于预冷的生理盐水并移入超净工作台内。在无菌条件下清洗绒毛组织表面的血渍后，置入预冷的生理盐水(含Pen/Strep及两性霉素)浸泡30 min。弃生理盐水，将绒毛组织尽量剪碎移入50 mL离心管中，加入5 mL 体积分数0.1%Ⅰ型胶原酶及5 mL 体积分数0.2%Ⅱ型Dispase酶(可根据组织量适当加入等比例的Ⅰ型胶原酶和Ⅱ型Dispase酶)，37 ℃水浴震荡消化30 min(具体时间视组织量而定)。经200 μm细胞筛网滤过后，滤过的组织用5 mL 体积分数0.02%Ⅰ型DNA酶和5 mL 0.25%胰酶进行二次消化，37 ℃水浴震荡消化20 min。经 200 μm细胞筛网滤过，在滤液中加入等体积的胎牛血清终止消化。

单细胞悬液制备：将混合消化液于4 ℃，1 000 r/min离心10 min，弃上清，用DMEM培养液重悬细胞。

Percoll密度梯度的制备：预先用Percoll与体积分数8.5% NaCl按9∶1配制成体积分数90% Percoll母液，再用体积分数8.5% NaCl稀释为25%，30%和35%，每个体积分数用3 mL稀释。再缓慢的将3个不同密度的Percoll溶液按体积分数从大到小的顺序逐层加入15 mL离心管内，制成25%-30%-35% Percoll密度梯度分离液。

人胎盘微血管内皮细胞分离与培养：

分离：将制备好的单细胞悬液沿管壁缓慢逐层加入25%-30%-35% Percoll分离液上层，每层加入1 mL单细胞悬液，20 ℃ 400×g 离心20 min。用枪头小心吸取距离液面2.0-4.0 cm处云雾状的细胞带置于50 mL离心管内，用完全培养液稀释4倍，37 ℃ 1 000 r/min离心5 min，以洗掉Percoll分离液。弃上清，用完全培养液重悬细胞接种于25 cm³培养瓶内，37 ℃体积分数5%CO₂细胞培养箱内孵育。培养24 h后首次换液，去除细胞碎片。以后每隔两三天换液1次，倒置光显微镜下观察细胞形态及生长情况。

人胎盘微血管内皮细胞的纯化：采用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。待细胞浓度融合80%以上时，加入适量体积分数0.25%胰酶进行消化，倒置显微镜下观察，发现部分细胞皱缩变圆，立即加入等体积完全培养基终止消化，来回轻摇一两次后，弃培养基，再用少量1×PBS漂洗1遍。然后再加入体积分数0.25%胰酶消化30-60 s，用等体积完全培养基终止消化，收集消化液于15 mL离心管中，1 000 r/min 离心5 min、弃上清，细胞沉淀用完全培养基重悬于25 cm²培养瓶中继续培养，细胞培养箱内孵育30 min后，倒置显微镜下观察，见部分细胞贴壁，轻轻摇动也不浮起时，将细胞悬液导入另一培养瓶中继续培养。反复操作3-5次即可分离出纯净的胎盘微血管内皮细胞。

传代培养：倒置显微镜下观察，待细胞融合80%以上时，用0.25%胰酶消化一两分钟，细胞皱缩变圆，加入等体积完全培养基终止消化。收集消化细胞置15 mL离心管中，1 000 r/min 离心10 min。加入适量培养液重悬细胞，吹打混匀，按1∶2传代。

人胎盘微血管内皮细胞的鉴定：

形态学观察：倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，并摄片。

细胞表面CD31抗体及FⅧ因子相关抗原的免疫细胞荧光化学双染检测：将第4代细胞接种于预铺有多聚赖氨酸的4孔板内，待细胞贴壁生长融合至80%左右时，弃4孔板内的培养液，加入pH 7.0的1×PBS冲洗2次，5 min/次。质量浓度40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，5 min/次；0.1%TritonX-100室温孵育15 min，用PBS冲洗3次，5 min/次；室温下滴加5%新鲜牛血清封闭90 min，PBS冲洗3次，5 min/次。加入兔抗人FⅧ因子相关抗原抗体一抗200 μL (1∶100) 4 ℃过夜；次日PBS冲洗3次，5 min/次，然后同时滴加鼠抗人PE-CD31一抗(1∶40)与FITC-羊抗兔IgG二抗各150 μL室温避光孵育100 min，PBS洗3次，5 min/次，DAPI染色液室温避光孵育30 min，PBS冲洗3次，5 min/次，荧光倒置相差显微镜下观察细胞，随机取10个高倍视野(×200)计数阳性细胞及细胞总数。阳性染色细胞率=(阳性细胞数/细胞总数)×100%。设立相应的阴性对照组，以PBS代替一抗，其他步骤同上。

细胞生长曲线测定：选取第5代胎盘微血管内皮细胞，调整接种密度为2×10⁷ L^-1接种于96孔板上，每隔24 h取6孔细胞加MTT溶液(质量浓度5 g/L) 20μL/孔，37 ℃孵育4 h后终止培养，小心吸弃培养液清液，每孔加150 μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min使结晶物充分溶解。酶联免疫监测仪上以490 nm波长处测定各孔吸光度值(A)，连测7 d。以时间为横轴，每日所测平均A值为纵轴绘制细胞生长曲线。

主要观察指标：人胎盘微血管内皮细胞的形态学及免疫荧光染色的鉴定。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

实验采用了一种较温和的方法分离胎盘微血管内皮细胞。本次实验选择适宜的酶浓度及消化时间尽可能减少酶对细胞的刺激，避免将血管壁更深层的细胞消化下来造成污染。实验首先选择使用细胞毒性较小的胶原酶/Dispase酶混合液进行初步消化，二次消化时选用小剂量、低浓度的DNA酶/胰酶混合液进行短时间消化，充分分离细胞。所获细胞再经非连续 Percoll密度梯度离心法分选后，立即用大量完全培养基(4倍体积)重悬细胞，尽量洗掉洗掉 Percoll分离液，减少Percoll分离液对细胞的毒性作用。最后利用内皮细胞生长、贴壁的特性，采用胰酶消化法和反复贴壁法对目标进行纯化，与免疫磁珠法相比，更好的保护细了胞活力。

实验利用改良的胎盘微血管内皮细胞分离方法进行培养，与以往培养方法的不同之处在于：①将以往实验中^[17^-^18]三步消化法简化为两步，并将消化时间缩短至1 h以内。②实验主要通过胰酶消化法和反复贴壁法对人胎盘微血管内皮细胞进行纯化。妊娠早期的绒毛组织中含有多种细胞，包括滋养层细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、周细胞和血细胞等^[20]，因而经非连续Percoll密度梯度离心的获得的人胎盘微血管内皮细胞可能有杂细胞污染。本次实验利用成纤维细胞、血管内皮细胞及周细胞3种细胞对胰酶的耐受性及贴壁时间的不同来纯化胎盘微血管内皮细胞，结果表明，此法明显提高了人胎盘微血管内皮细胞的纯度。③实验在使用非连续 Percoll密度梯度离心后，发现云雾状细胞带在距液面下2.0-4.0 cm处均有分布，获取细胞带做细胞培养，经纯化后证实为血管内皮细胞。④与磁珠分选法及流式细胞仪分选法相比，方法简单易行，对细胞损伤较小且价钱便宜。⑤本次实验并未在培养液中添加任何细胞生长因子，降低了实验成本。

实验结果还提示，要成功获取胎盘微血管内皮细胞应注意以下几点：①绒毛组织应新鲜，严格遵守无菌操作，有助于提高细胞成活率，另外务必要将绒毛组织冲洗干净，以减少血细胞污染。②尽量将绒毛组织剪碎，组织越碎与酶接触越充分，可缩短酶消化时间，减x少酶对细胞的刺激。③细胞纯化对成功获取人胎盘微血管内皮细胞非常重要，经非连续 Percoll密度梯度离心后获得的原代人胎盘微血管内皮细胞，会有少量血细胞污染，血细胞为非贴壁细胞，换液即可去除。相较于血管内皮细胞和成纤维细胞，周细胞对胰酶的耐受性最好，需经较长时间(5-10 min， 1.0-2.0 min，20 s)才能从培养瓶上消化下来^[10]，通过短时间胰酶消化即可去除周细胞。成纤维细胞对胰酶最为敏感且更易贴壁，利用这个特点可将成纤维细胞和血管内皮细胞分开，达到纯化的目的^[21-23]。在传代时用胰酶消化约 10 s，镜下观察发现有细胞脱落立即终止消化，弃消化液，去除一部分成纤维细胞；然后加入胰酶继续消化1 min，终止消化，离心后收集细胞，接种至培养瓶中37 ℃体积分数5%CO₂培养箱内孵育30 min，镜下见部分细胞贴壁，将细胞悬液导入另一培养瓶，进一步去除成纤维细胞。多次重复此操作可将成纤维细胞与血管内皮细胞分离。用MTT法检测纯化后人胎盘微血管内皮细胞生长曲线，结果显示细胞生长曲线近似倒“S”形，符合“缓慢增殖期、对数生长期和增殖平台期”的生长模式。

为进一步证实培养的是人胎盘微血管内皮细胞，实验采用CD31及Ⅷ因子相关抗原抗体(vWf)双荧光染色进行鉴定，结果显示本次实验所培养的目的细胞中CD31与vWf抗体呈高表达状态(阳性率为100%)，与以往文献报道结果相似^[24-25]。vWf抗体被认为是鉴定血管内皮细胞的特异性标记物^[26-27]，CD31在血管内皮细胞中表达且重复性较好^[15]。内皮细胞另一特异性标志是Weible-Palade 小体(W-P小体)，但本次实验电镜观察后并未观察到W-P小体(图片未提供)，这可能是由于电镜切片制作缘故，另外，也有研究认为电镜并不适于观察数量较多的细胞^[28]。

综上所述，实验在借鉴前人技术的基础上^[1，17]，通过两步酶消化法结合非连续 Percoll密度梯度离心法成功获取人胎盘微血管内皮细胞，通过鉴定符合血管内皮细胞性质，为体外研究胎盘血管内皮细胞生物学特性提供良好的实验模型，对进一步研究胎盘屏障的功能及相关疾病有重要意义。

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